Applicazioni alla proteomica: la spettrometria di massa
La spettrometria di massa è considerata strumento indispensabile in protemica, la scienza che studia l’insieme delle proteine espresse dal genoma di un organismo. La scelta del metodo di separazione nonché della strategia da adottare al fine di semplificare le complesse miscele da analizzare mediante spettrometria di massa al centro della lezione del ricercatore in chimica organica, Vincenzo Cunsolo. La lezione è parte dell'attività formativa (OF3) del progetto BRIT (Bio-nanotech Research and Innovation Tower).
Negli ultimi decenni il rapido sviluppo tecnologico nel campo della biologia molecolare ha contribuito a spostare l'attenzione dei ricercatori dalla caratterizzazione di singole proteine allo studio di miscele proteiche molto complesse. Da questo punto di vista pertanto la proteomica rappresenta una naturale evoluzione della chimica delle proteine. In particolare, gli studi proteomici hanno tratto un enorme vantaggio dall'introduzione dei metodi soft di ionizzazione (ESI e MALDI) in spettrometria di massa, la quale è divenuta uno strumento indispensabile in proteomica.
Gli studi di proteomica prevedono la contemporanea caratterizzazione di diverse migliaia di proteine e pertanto richiedono l'utilizzo di una tecnica di separazione ad alto potere risolutivo (ad es. gel elettroforesi e cromatografia liquida) al fine di semplificare le complesse miscele da analizzare successivamente mediante spettrometria di massa. La scelta del metodo di separazione nonché della strategia da adottare dipende sia dalla tipologia di proteine da analizzare, che dall'obiettivo finale da raggiungere. Tali studi possono essere condotti attraverso due differenti tipologie di analisi, note come "bottom-up" e "top-down". Nell'approccio "bottom-up" la caratterizzazione della struttura primaria della proteina avviene mediante lo studio dei peptidi prodotti da reazioni di digestione enzimatica della proteina stessa. In particolare, tale strategia prevede la separazione, visualizzazione e quantificazione dei singoli componenti di una miscela proteica mediante elettroforesi su gel, uno step di digestione enzimatica in-gel e la successiva fase di identificazione mediante spettrometria di massa e ricerca in banche dati. D'altra parte, la digestione delle proteine presenti in miscela può essere effettuata senza alcuna preventiva separazione delle stesse. In tal caso, il digerito enzimatico contenente i peptidi provenienti da tutte le proteine presenti nella miscela iniziale, viene sottoposto ad una separazione con cromatografia bidimensionale accoppiata on-line con la spettrometria di massa tandem (approccio "shotgun" o MudPIT, Multidimensional Protein Identification Technology).
La strategia "top-down" è una strategia d'analisi emergente che permette di ottenere contemporaneamente informazioni sulla massa di proteine intere nonché dati (parziali) sulla sua sequenza aminoacidica. In particolare, le complesse miscele proteiche vengono preventivamente separate in singole proteine o in miscele meno complesse. Questa fase è seguita da un'infusione diretta o un'analisi on-line (LC/MS) del campione in uno spettrometro di massa a ionizzazione ESI ad alta risoluzione per la misura della massa esatta delle proteine. Attraverso la frammentazione (mediante metodi ETD o HCD) di ioni multi-carica delle proteine in esame è inoltre possibile ottenere informazioni sulla loro struttura primaria, senza il ricorso a preventive reazioni di digestione enzimatica. Indipendentemente dalla strategia utilizzata, i dati sperimentali vengono utilizzati per interrogare, mediante specifici tools bioinformatici (MASCOT, Ms-Fit, ProFound), le banche dati proteiche, genomiche e ESTs (expressed sequence tag), al fine di ottenere informazioni sulle proteine investigate. Da questo punto di vista, l'interpretazione dei dati ottenuti mediante spettrometria di massa rappresenta un altro passo fondamentale negli approcci proteomici, che hanno come principali obiettivi l'identificazione del maggior numero di proteine presenti nella miscela investigata, la determinazione del loro livello di espressione, la caratterizzazione delle modifiche post-traduzionali, la determinazione di eventuali interazioni proteiche, nonché la loro distribuzione sub-cellulare.
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